Bakterie są jednymi z najstarszych żywych organizmów na Ziemi. Mimo prostszej budowy, w porównaniu do organizmów eukariotycznych, bakterie pełnią ważną funkcję w przyrodzie. Uczestniczą w obiegu pierwiastków, rozkładzie martwej materii organicznej, bytują w przewodzie pokarmowym zwierząt itd. Organizmy te znalazły też zastosowanie w produkcji żywności. Z drugiej strony powodują jej psucie. Artykuł ten pozwoli czytelnikowi zapoznać się z pozytywną i negatywną rolą tych drobnoustrojów w produkcji żywności.
Czym są bakterie?
Bakterie należą do królestwa Prokaryota, wśród której są także Archeony. Organizmy te występują we wszystkich typach środowiska — wodzie, powietrzu, glebie, żywej i martwej materii organicznej. Komórki tych drobnoustrojów cechują się niewielkim zróżnicowaniem kształtów. Podstawowymi kształtami komórek bakteryjnych są: kulisty, cylindryczny i spiralny.
Bakterie o kształcie kulistym mogą występować jako: dwoinki (Diplococcus), łańcuszki (Streptococcus), czworniaki (Tetracoccus), grona (Staphylococcus) lub pakietowce (Sarcina).
Wśród form cylindrycznych wyróżnia się pałeczki (Bacterium) i laseczki (Bacillus). Te pierwsze nie tworzą form przetrwalnikowych. Bakterie z obu tych grup mogą występować jako pojedyncze komórki lub łańcuszki.
Wśród form spiralnych wyróżnia się: przecinkowce (Vibrio), krętki (Spirochetae) i śrubowce (Spirillum). Jest to tradycyjny podział kształtów komórek bakteryjnych i ich zgrupowań.
Jednakże spotyka się również bakterie styliskowe (należą do bakterii pączkujących), bakterie o kształcie pochewkowatym i nitkowatym (bakterie siarkowe i żelaziste), gruszkowatym, kwadratowym, ameboidalnym, gwiazdowatym, w postaci nieobłonionych ciałek elementarnych lub jako komórki olbrzymie.
Długość komórki bakteryjnej waha się w granicach 0,5-5 µm, a powierzchnia 0,8-7 µm.
Specyficzną grupą bakterii są promieniowce, które z wyglądu i sposobu rozmnażania są podobne do strzępki grzyba. Bakterie te tworzą rozgałęzione nitki i strzępki zarodnionośne ze sporami.
Budowa bakerii
Komórka bakteryjna różni się pod względem budowy od komórki eukariotycznej. Elementami komórki bakteryjnej są: ściana komórkowa, błona komórkowa, genofor, rybosomy, materiały zapasowe, rzęski i otoczki.
Lwia część bakterii posiada ścianę komórkową, wyjątkiem są mykoplazmy. Rolą ściany komórkowej jest ochrona przed czynnikami zewnętrznymi, nadaje ona komórce kształt oraz dzięki niej komórka może utrzymać odpowiedni turgor (ciśnienie osmotyczne). Ze względu na budowę ściany komórkowej bakterie dzieli się na 2 grupy, a kryterium podziału jest metoda Grama, pozwalająca na barwienie komórek bakteryjnych.
Przygotowany mikroskopowy preparat bakterii barwi się fioletem krystalicznym, następnie płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu), w wyniku czego w komórce powstaje nierozpuszczalny kompleks jodu i fioletu krystalicznego. Następnie preparat jest płukany etanolem, który wymywa nierozpuszczalne kompleksy, a po barwieniu fuksyną bakterie mogą zabarwić się na różowo.
Właśnie na ten kolor przyjmują komórki bakterii gramujemnych, a bakterie gramdodatnie pozostają fioletowe, ponieważ dzięki specyficznej budowie ściany komórkowej etanol nie wypłukuje z nich kompleksów barwników.
Bakterie należące do tych grup różnią się nie tylko budową ściany komórkowej, ale też takimi właściwościami jak: wrażliwość na antybiotyki, temperaturę sterylizacji czy detergenty.
Bakterie gramdodatnie posiadają wielowarstwową ścianę komórkową, złożoną z ok. 40 warstw mureiny (peptydoglikanu, mukopeptydu), przez co substancja ta stanowi ok. 90% ich ściany. Grubość ściany tych bakterii waha się w granicach 15-80 nm. W skład ściany, poza mureiną wchodzą też polisacharydy kwasowe tkz. kwasy tejchojowe, posiadające ładunek ujemny, które mają wpływ na przepływ jonów przez ścianę komórkową.
W ścianach tych bakterii ponadto występuje lizyna. Ściana komórkowa bakterii gramujemnych jest stosunkowo cienka (ok. 10 nm), składa się z jednowarstwowej siatki mureiny, ale nie zawiera kwasów tejchojowych, ale znaczne ilości białek i lipidów, a także kwas diaminopimelinowy (DAP). Cechą charakterystyczną tych bakterii jest obecność drugiej błony komórkowej – błony zewnętrznej. Jest ona łatwo przepuszczalna dla małych cząsteczek, zawiera także białka- poryny, przez które możliwy jest transport substancji hydrofilnych. Błona zewnętrzna zawiera polisacharyd, przez co błonę tę nazywa się też lipopolisacharydową.
Niektóre bakterie wytwarzają otoczki różnej grubości. Otoczka nie jest trwale związana ze ścianą komórkową i wytwarzana jest w określonych fazach rozwojowych. Pod względem chemicznym otoczka składa się z: polimerów cukrów, aminocukrów, kwasów uronowych, a czasami też pektyn.
Rolą otoczek jest ochrona komórek przed czynnikami zewnętrznymi. Większość bakterii posiada rzęski, będące organami ruchu, składające się z białka flagelliny, a wyrastają one z ciałka podstawowego. Bakterie mogą poruszać się też ruchem ślizgowym na stałych powierzchniach, a bakterie wodne wytwarzają pęcherzyki gazowe, regulujące ich pozycję w wodzie. Niektóre bakterie gramujemne posiadają fimbrie lub pilie, będące białkowymi wyrostkami cytoplazmatycznymi, które umożliwiają drobnoustrojom patogennym adhezję na powierzchni tkanek zwierzęcych oraz tworzenie biofilmów.
Pilie są dłuższymi wyrostkami od fimbrii są mniej liczne, występują u tych bakterii, które różnią się „płciowo” (koniugacja). Między ścianą i błoną komórkową znajduje się przestrzeń zwana peryplazmą. Przestrzeń ta pełni funkcję ochronną np. obecne w niej enzymy degradują penicylinę; odżywczą, są w niej bowiem enzymy hydrolizujące (amylazy, peptydazy, fosfatazy, nukleazy) i transportową.
Błona cytoplazmatyczna składa się z lipidów i białek, których wzajemny stosunek jest zależny od gatunku bakterii i ich fazy rozwojowej. Plazmalemma uczestniczy w transporcie substancji odżywczych, który może odbywać się na drodze biernej dyfuzji, dyfuzji ułatwionej, transportu wspomaganego enzymatycznie przez permeazy lub transportu aktywnego.
Cechą charakterystyczną prokariontów jest brak jądra komórkowego. Materiał genetyczny bakterii występuje w postaci nukleoidu lub genoforu – długiej podwójnej nici DNA, która jest koliście zamknięta. Wkłada się w prawie wyłącznie z pojedynczych genów, sekwencji niedokujących jest niewiele.
Komórki bakteryjne posiadają także plazmidy, które są odpowiedzialne za cechy odpowiedzialne za odporność na antybiotyki, synteza bakteriocyn . Podobnie jak u eukariontów, u bakterii w biosyntezie białka uczestniczą rybosomy. Bakterie mają zdolność do gromadzenia substancji zapasowych, takich jak: granuloza, beta-hydroksymaślany, wolutyna, glikogen i siarka koloidalna.
Niektóre bakterie wykazują zdolność do tworzenia form przetrwalnikowych: cyst, endospor i egzospor. Przetrwalniki mają charakterystyczną strukturę fizykochemiczną, nadającą im oporność na działanie wysokiej temperatury, odwodnienia, substancji chemicznych, promieniowania i innych czynników chemicznych i fizycznych, która to odporność jest większa, niż u form wegetatywnych.
Przetrwalniki
Przetrwalniki mogą przeżyć długi okres czasu w warunkach zabójczych dla form wegetatywnych. Zdolność do tworzenia endospor wykazują głównie laseczki (Bacillus i Clostridium). U Bacillus przetrwalniki nie zmieniają kształtu, natomiast u Clostridium ednospora może mieć postać wrzecionowatą (klostridium), gdy powstaje w centralnej części komórki, lub może być buławkowata (plektridium), gdy powstaje przy biegunie komórki.
Proces powstawania przetrwalników, zwany cyklem sporulacji polega na przemianach biochemicznych i syntezie nowych składników. Spora składa się z rdzenia, który stanowi protoplastę przetrwalnika. Zawiera on nukleoid i elementy odpowiedzialne za syntezę enzymów i wytwarzanie energii. Ściana przetrwalnika składa się z mureiny, po wykiełkowaniu spory staje się ścianą komórkową.
Kolejnym elementem ednospory jest korteks, kwas dipikolinowy, osłony białkowe i egzosporium. Formy przetrwalne zawierają 4 razy mniej sacharydów niż formy wegetatywne i 40% więcej białek. Osłony, nadające przetrwalnikom oporność na czynniki środowiskowe stanowią do 50% objętości i 60% suchej masy endospory.
Wrażliwość przetrwalników na temperaturę jest różna. Ekspozycja na temperaturę 80°C przez 1 min. wystarczy do uśmiercenia bakterii nieprzetrwalnikujących i form wegetatywnych bakterii. Przetrwalniki słabo oporne giną w temperaturze 90°C po 10 min. po 30 min. giną przetrwalniki średniooporne, a w temperaturze 100-105°C giną przetrwalniki oporne. Do tej ostatniej grupy należą Clostridium sporogenes i Geobacillus stearothermophilus, które giną po ekspozycji na temperaturę 115°C po 10 min.
Zatem pasteryzacja nie jest wystarczająca do uśmiercenia większości przetrwalników, natomiast sterylizacja może zapewnić bezpieczeństwo mikrobiologiczne. Ciepłooporność przetrwalników wynika z ich odwodnienia. Spory są ciepłooporne, dopóki substancja rdzenna jest nieuwodniona. Po nawodnieniu przetrwalnik staje się wrażliwy na temperaturę. Cysty są komórkami o okrągłym kształcie i grubych ścianach. Są one formą przetrwalną u niektórych bakterii. Inna forma przetrwalna – egzospory, pod względem właściwości przypomina endospory, z tym, że są wytwarzane przez bakterie wykorzystujące metan (Nicklin, Graeme-Cook, i Killington 2012, Gawęcki i Libudzisz 2016).
Pozytywna rola bakterii w produkcji żywności
Bakterie od wieków są wykorzystywane w produkcji i utrwalaniu żywności i pasz.
Stosowanie tych mikroorganizmów w przemyśle spożywczym ma charakter dwukierunkowy. Kwasy organiczne, enzymy i inne metabolity wytwarzane przez bakterie mogą być same w sobie produktem lub substancją dodawaną do żywności. W innym przypadku bakterie uczestniczą w procesach technologicznych poprzez kształtowanie właściwości sensorycznych i reologicznych produktów spożywczych.
W przemyśle spożywczym najczęściej wykorzystuje się bakterie fermentacji mlekowej, propionowej i octowej, które wytwarzają kwasy organiczne, będące głównym produktem przeprowadzanej przez nie fermentacji. Istnieją też bakterie np. Zymomonas, które potrafią przeprowadzić proces fermentacji alkoholowej.
Bakterie kwasu mlekowego
Najpowszechniej używanymi bakteriami są bakterie kwasu mlekowego, stosowane w przemysłowej produkcji żywności i pasz, ale też i w przetwórstwie domowym. Zdolność do przeprowadzania fermentacji mlekowej posiada wiele bakterii: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus, Enterococcus i Leuconostoc. Drobnoustroje te różnią się pod względem preferencji środowiskowych, termicznych i substratowych.
Poszczególne gatunki Lactobacillus wykazują zdolność do fermentowania różnych sacharydów i różny zakres optymalnych temperatur. Ma to istotne znaczenie przy wyborze szczepu do danego procesu. Głównym celem fermentacji mlekowej jest otrzymanie mleczanu, ale w rzeczywistości rola tych bakterii jest znacznie szersza.
Bakterie kwasu mlekowego umożliwiają produkcję mleczanu w warunkach przemysłowych, dzięki syntezie bakteriocyn i obniżaniu pH zwiększają trwałość żywności, kształtują cechy sensoryczne żywności i zwiększają wartość odżywczą produktów spożywczych (poprawa strawności i przyswajalności).
Fermentacja mlekowa to proces beztlenowy, w której w wyniku reakcji enzymatycznych cukry zostają zmetabolizowane do mleczanu. Bakterie mogą wytwarzać mleczan w sposób homofermentatywny. Wówczas powstaje tylko ten kwas, lub w sposób heterofermentatywny, wtedy oprócz mleczanu powstaje też octan.
Mleczan powstały w przemyśle spożywczym znajduje zastosowanie w przetwórstwie owocowo-warzywnym, piwowarskim i piekarskim. Najczęściej wykorzystywanymi bakteriami w przemysłowej produkcji mleczanu są: Lactobacillus delbruecki, L. leichmanni, L. casei i Lactococcus lactis. Gatunki te zapewniają dużą wydajność produkcji mleczanu, wytwarzają mało produktów ubocznych. Wytwarzają głównie formę L(+) kwasu mlekowego, którą organizm lepiej przyswaja.
Substratem do otrzymania mleczanu jest sacharoza, ale stosuje się też inne surowce węglowodanowe, takie jak: melasa, syropy skrobiowe, skrobia zhydrolizowana i laktoza z serwatki. Poza cukrami, bakterie potrzebują także źródła azotu i innych składników, a ich źródłem dla drobnoustrojów są zarodki pszenne i żytnie, suszone kiełki zbożowe i preparaty drożdżowe.
Proces produkcji mleczanu jest wieloetapowy: przygotowanie pożywki i jej zaszczepienie kulturą starterową, fermentacja i zneutralizowanie powstałego mleczanu, oczyszczanie i zagęszczanie roztworu kwasu i rozszczepianie.
Podstawową pożywką jest roztwór sacharozy z dodatkiem zarodków pszennych, która jest inokulowana szczepionką. Fermentacja trwa ok. 7 dni, a zachodzi ona w temperaturze 35-50°C. Powstały kwas mlekowy zostaje zneutralizowany węglanem lub wodorotlenkiem wapnia, jest to czynność konieczna, ponieważ nadmierne stężenie tego kwasu jest szkodliwe dla bakterii.
Mleczan wapnia jest następnie oczyszczany i rozszczepiany do mleczanu.
Kiszenie
Bakterie fermentacji mlekowej odgrywają ważną rolę w utrwalaniu żywności, a proces ten nazywany jest potocznie kiszeniem. Otrzymywany w wyniku fermentacji mleczan obniża odczyn środowiska poniżej 4,2; które jest zbyt niskie dla wielu mikroorganizmów niepożądanych w żywności.
Bakteriocyny wytwarzane przez bakterie kwasu mlekowego są dodatkowym czynnikiem utrwalającym. Proces kiszenia zachodzi w określonych warunkach: zakwaszany produkt musi zawierać cukry odpowiednią mikroflorę mlekową, warunki względnie beztlenowe, wilgotność surowca w zakresie 50-70% i jego dobre rozdrobnienie.
Surowcami w produkcji kiszonek są przede wszystkim warzywa, zwłaszcza kapusta i ogórki, ale kisi się również kapustę czerwoną, brukselkę, seler, cebulę, buraki, paprykę i zielone pomidory.
Kapusta kiszona
Pierwszym etapem w produkcji kiszonej kapusty jest przygotowanie surowca. Z kapusty powinno się usunąć chlorofil poprzez proces bielenia – przechowywania w ciemności. Dalej z główek kapusty usuwa się zewnętrzne liście i ewentualne nadpsute fragmenty.
Oczyszczone główki są szatkowane na krajankę i umieszczane w beczkach, silosach lub słojach. Podczas napełniania zbiornika poszatkowaną kapustą przesypuje się ją solą kuchenną w ilości 2-3%, można też dodać dodatki w celu polepszenia smaku, takie jak: marchew, jabłka, nasiona kopru czy kminku.
Następnie ze zbiornika usuwane jest powietrze. Sól powoduje zmianę ciśnienia osmotycznego i dyfuzję soku komórkowego poza tkanki surowca, staje się on pożywką dla bakterii.
Przeprowadzana w ten sposób fermentacja ma charakter spontaniczny, choć w przemysłowej produkcji kapusty kiszonej można też stosować kultury starterowe.
Proces fermentacji krajanki składa się z 3 etapów.
Pierwszy jest zafermentowanie, które trwa ok. 2 dni, następnie etap fermentacji burzliwej, trwający 4-7 dni w temperaturze ok. 18°C. Ostatnim etapem jest dojrzewanie kiszonki przez kilka tygodni, wówczas nabiera ona odpowiednich cech smakowo-zapachowych.
Ogórki kiszone
W warunkach przemysłowych wyrób gotowy zostaje przeniesiony z silosów do beczek i przekazany do dystrybucji. Proces kiszenia ogórków pod wieloma względami przypomina kiszenie kapusty, ale różni się w 2 aspektach.
Ogórki nie są rozdrabniane, natomiast są myte i moczone. Ogórki, które przeznacza się do kiszenia, nie powinny być w pełni dojrzałe. Powinny być proste, a ich rozmiary powinny być wyrównane. Pozostałości kwiatostanu muszą zostać z nich usunięte, ponieważ mogłyby powodować mięknięcie podczas kiszenia.
Ogórki zostają poddane sortowaniu, myciu, moczeniu, następnie umieszcza się je w zbiornikach, basenach czy beczkach, dodając przyprawy: czosnek, koper, chrzan, gorczycę, liście dębu, wiśni lub czarnej porzeczki.
Dalej ogórki z przyprawami zalewa się roztworem soli kuchennej (3-8%). Zbiornik zamyka się, a proces fermentacji trwa 1-6 tygodni w temperaturze 15-25°C, zależnie od fazy fermentacji. Ogórki kiszone cechują się mniejszą trwałością od kapusty kiszonej, więc powinny być przechowywane w warunkach chłodniczych.
Jogurty, kefiry, kwaśne mleko
Bakterie fermentacji mlekowej stosuje się w przemyśle mleczarskim. Mikroflora ta kształtuje reologiczne i organoleptyczne właściwości produktów mleczarskich poprzez odfermentowywanie laktozy w mleczan i przemiany lipidów i białek.
W przemyśle mleczarskim używa się gotowych szczepionek, zawierających bakterie z rodzaju Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc i Bifidobacterium. Mikroflora mlekowa jest stosowana w produkcji mlecznych napojów fermentowanych, serów i masła.
Fermentowane napoje mleczne cechują się wieloma prozdrowotnymi właściwościami. Najpopularniejszymi produktami tego typu są jogurty, kefiry i kwaśne mleko.
W produkcji jogurtu wykorzystuje się bakterie Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus. Proces fermentacji trwa kilka godzin w temperaturze ok. 45°C, w wyniku którego mikroflora wytwarza głównie mleczan, ale też niewielkie ilości aldehydu octowego. W produkcji kefiru, poza bakteriami kwasu mlekowego wykorzystuje się też drożdże.
Kultura starterowa (zwana ziarnami lub grzybkami kefirowymi) w tym przypadku składa się z bakterii: Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus i Acetobacter, oraz drożdży: Saccharomyces, Candida i Kluyveromyces. Dzięki tak urozmaiconej mikroflorze kefir zawiera więcej metabolitów wpływających na smak i zapach niż jogurt.
Sery
W serowarstwie bakterie kwasu mlekowego są odpowiedzialne za powstanie skrzepu, szczególnie w przypadku wytwarzania twarogów kwasowych. Uczestniczą w tym bakterie z rodzaju Lactobacillus i Lactococcus.
W przypadku produkcji serów podpuszczkowych dojrzewających bakterie te uczestniczą też w etapie dojrzewania sera, w czym towarzyszą im bakterie fermentacji propionowej Propionibacterium, dla których substratem jest mleczan.
Bakterie kwasu mlekowego stosuje się też w produkcji masła, a konkretnie w celu ukwaszenia śmietanki, co ułatwia w etapie zmaślania łączenie się kuleczek tłuszczu. W skład zakwasu maślarskiego wchodzi kilka gatunków bakterii z rodzaju Lactococcus i Leuconostoc (Bisen 2014, Gawęcki i Libudzisz 2016)
Fermentowane wędliny
Bakterie znajdują też zastosowanie w przemyśle mięsnym, wykorzystuje się je w produkcji fermentowanych wędlin, np. szynki, wędzonek i kiełbas (salami, metka, polska surowa).
Produkcja tych wędlin obejmuje następujące etapy: rozdrabnianie surowca, dodatek soli i przypraw i szczepionek, fermentację, podsuszanie lub suszenie i wędzenie. Mikroflora obniżenia pH mięsa, co zwiększa jego trwałość, a także nadaje wędlinom charakterystyczny smak, zapach i barwę.
Najważniejszymi bakteriami stosowanymi w produkcji fermentowanych przetworów mięsnych są Lactobacillus i Pediococcus, a obok nich wykorzystuje się też bakterie Micrococcus i Staphylococcus, które potrafią redukować azotany.
Ocet
Poza bakteriami fermentacji mlekowej w przemyśle spożywczym wykorzystuje się również bakterie octowe, przeprowadzające fermentację octową. Proces ten jest procesem tlenowym, charakterystycznym dla bakterii z rodzaju Acetobacter, które utleniają alkohol etylowy do kwasu octowego. Reakcja ta jest katalizowana przez oksydazy.
Ocet jest znany ludzkości od wieków, początkowo w wyniku octowania wina. W produkcji octu wyróżnia się metodę powierzchniową, ociekową i wgłębną. Metoda powierzchniowa jest najstarsza, dziś stosuje się ją do otrzymania octu winnego. Wino fermentuje w płytkich i szerokich, otwartych zbiornikach. Otrzymany ocet winny zawiera 6-8% octanu, a jego aromat i barwa pochodzą od wina. Metoda ociekowa i wgłębna są stosowane do produkcji octu spirytusowego.
Pożywką dla bakterii w tym przypadku są spirytus rektyfikowany lub spirytus surowy, zawierający niewiele zanieczyszczeń, woda i składniki mineralne. Fermentacja metodą ociekową zachodzi w generatorach, w których zaszczepiona pożywka płynie po powierzchni zbiornika, co pozwala na maksymalne natlenienie.
W przypadku metody wgłębnej stosuje się bioreaktory z systemem napowietrzania i termoregulacji. W procesie produkcji octu istotną kwestią jest kontrolowane dostarczania tlenu, gdyż jego nadmiar prowadzi do nadoksydacji – utlenienia etanolu do wody i dwutlenku węgla, co obniża wydajność produkcji octu. Otrzymany ocet spirytusowy jest roztworem kwasu octowego o stężeniu 10-14%.
Produkty w warunkach domowych
Zsiadłe mleko
Wiele produktów spożywczych z udziałem bakterii można wytworzyć w warunkach domowych. Przykładem jest zsiadłe mleko. Można je otrzymać dzięki samoczynnej, spontanicznej fermentacji niepasteryzowanego mleka, która jest przeprowadzana przez paciorkowce mlekowe, bakterie z grupy coli, bakterie przetrwalnikujące, drożdże i pleśnie.
Optymalna temperatura dla fermentacji mieści się w zakresie 20-25°C, ponieważ w tych warunkach paciorkowce mlekowe dominują nad pozostałą mikroflorą. Ponieważ kwaśne mleko powstaje w wyniku spontanicznej fermentacji, istnieje ryzyko jego zakażenia przez bakterie chorobotwórcze.
Odczyn 5,5-6,0 jest zabójczy dla większości bakterii, ale niektóre mogą bytować w środowisku o pH 4,5 np. pałeczki Salmonella. W związku z tym jakość zsiadłego mleka zależy od jakości higienicznej mleka.
Bezpiecznym sposobem otrzymania zsiadłego mleka jest zaszczepienie mleka pasteryzowanego małą ilością kwaśnego mleka lub śmietany. W wyniku fermentacji powstaje galaretowaty skrzep, z którego nie wycieka serwatka. Takie mleko cechuje się czystym, przyjemnym smakiem, przy braku obcych, niepożądanych posmaków.
Kwaśne mleko może posłużyć do przygotowania napojów mlecznych z dodatkiem lub bez owoców i warzyw oraz chłodników. W podobny sposób można ukwasić śmietankę, którą stosuje się do zaklepywania sosów i zup.
Ser twarogowy
W domowych warunkach można też otrzymać ser twarogowy poprzez łagodne ogrzewanie kwaśnego mleka. Kwas mlekowy powoduje przejście kazeiny w postaci rozpuszczalnego fosfokazeinianu wapnia w postać żelu, a kwas mlekowy przechodzi w mleczan wapnia.
Łagodne ogrzewanie powoduje wydzielenie skrzepu z serwatki. Kiszoną kapustę i ogórki, poza produkcją przemysłową można wytworzyć w warunkach domowych. Podstawową różnicą między przemysłowym a domowym kiszeniem tych warzyw jest pochodzenie mikroflory, która w pierwszym przypadku pochodzi z kultury starterowej, a w drugim jest to naturalna mikroflora bytująca na powierzchni warzyw.
Kiszona kapusta
W przypadku domowego kiszenia kapusty, surowiec jest szatkowany, nasolony w ilości 2-2,5% i ugniecony. Podczas fermentacji burzliwej, zachodzącej przez ok. 10 dni w temperaturze 18-22°C następuje rozwój bakterii kwasu mlekowego, przetrwalnikujących bakterii tlenowych, bakterii z grupy coli i drożdży.
W wyniku tego odczyn obniża się do 6,0; co skutkuje redukcją liczby bakterii z grupy coli, i zwiększeniem liczby mikroflory mlekowej heterofermentatywnej- Leuconostoc mesenteroides, która produkuje mleczan i octan, a w niewielkich ilościach również mrówczan, propionian, maślan, bursztynian, etanol i dwutlenek węgla, wpływające na cechy sensoryczne kiszonki.
W wyniku dalszego spadku pH do ok. 4,0 rozwój bakterii z grupy coli i bakterii gnilnych zostaje zahamowany, a powstały dwutlenek węgla wypiera pozostałości tlenu, co stwarza warunki dla fermentacji anaerobowej, przeprowadzanej przez bakterie homofermentatywne – Lactobacillus plantarum i Pediococcus pentosaceus.
W końcowym etapie fermentacji uczestniczy heterofermentatywna bakteria Lactobacillus brevis. Po 2 tygodniach fermentacji kapusta zawiera 1,5-1,8% mleczanu, a jej odczyn wynosi 3,4-3,5.
Następnie kapusta dojrzewa przez kilka tygodni w temperaturze 10°C. Gotowy wyrób należy przechowywać w warunkach chłodniczych.
Z powodu spontanicznej fermentacji przeprowadzanej przez komensalną mikroflorę na powierzchni liści kapusty, więc istnieje ryzyko nadmiernego rozwoju niepożądanej mikroflory – bakterii tlenowych, drożdży i pleśni, głównie Candida mycoderma i Geotrichum candidum.
Powodują one, że kapusta ma niewłaściwą barwę, smak i aromat oraz jest zbyt miękka. Niepożądana mikroflora rośnie na powierzchni kiszonki, a jako źródło węgla wykorzystuje kwasy organiczne, co obniża kwasowość kapusty, i stwarza warunki dla rozwoju bakterii gnilnych.
Ogórki małosolne
Ogórki małosolne przygotowuje się z całych ogórków, umieszczonych w zalewie o 3% stężeniu soli. Stosuje się też zalewy o 5-7% zawartości soli, które pozwalają na dłuższe przechowywanie. W fermentacji uczestniczy podobna mikroflora jak w przypadku kiszenia kapusty. Jednakże, w kiszonych ogórkach może następować rozwój bakterii z rodzaju Bacillus i z grupy coli, które mają zdolność rozkładania związków pektynowych, przez co w ogórkach powstają puste przestrzenie.
Zakwasy
Innymi produktami otrzymywanymi dzięki aktywności bakterii są zakwasy. Zakwas na żur jest przygotowywany z mąki razowej żytniej lub owsianej. Pożywką dla drobnoustrojów jest mieszanka ciepłej wody, mąki, soli, czosnku, która fermentuje 4-5 dni w temperaturze 20°C. W początkowej fazie fermentacji dominują paciorkowce- Lactococcus, Leuconostoc i Pediococcus, a później przeważają pałeczki.
Następnie mieszanka jest przelewana do słoików lub butelek, które zostają szczelnie zamknięte i przechowywane w lodówce do 2 tygodni. Z zakwasu przygotowuje się wiele rodzajów zup np. żurek, żur czy barszcz biały. Interesującym produktem otrzymywanym przy udziale bakterii kwasu mlekowego i drożdży jest kwas chlebowy. Powstaje on w wyniku fermentacji mlekowej i etanolowej zachodzącej w wodzie zlanej z rozmoczonego chleba po dodaniu drożdży i cukru.
Etap burzliwej fermentacji zachodzi przez dobę w temperaturze 20-24°C, dalej następuje trzydniowe dojrzewanie. Bakteriami uczestniczącymi w produkcji kwasu chlebowego są: Lactobacillus plantarum, L. brevis, L. fermentum i L. leichmanii.
Powstający kwas chlebowy to dobre środowisko do rozwoju drożdży i bakterii, ponieważ obie grupy mikroorganizmów wytwarzają metabolity stymulujący wzrost partnera. Produkowana przez drożdże ryboflawina wspomaga rozwój bakterii, a obniżenie pH do 4,5-5,0 dzięki aktywności bakterii stwarza dla drożdży optymalne warunki rozwoju.
Produkty orientalne
Kimchi
Gotowy kwas chlebowy zawiera 0,5-2% etanolu i 0,2-0,5% mleczanu. W krajach azjatyckich również wykorzystuje się bakterie w produkcji żywności. Produktem podobnym do naszej kiszonej kapusty wytwarzanym w Korei jest kimchi. Kimchi produkuje się z kapusty koreańskiej, rzodkiewki, cebuli, czosnku, sproszkowanej papryki i soli (ok. 3%), a także krewetek lub ryby.
Warzywa te fermentują w temperaturze 10-20°C. Mikroflora przeprowadzająca proces fermentacji składa się z: Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecalis, Lactobacillus brevis, L. plantarum i Pediococcus dextranicus. Odczyn końcowego produktu wynosi 4,2-4,5.
Chleb idli
Bakterie kwasu mlekowego są stosowane w wytwarzaniu indyjskiego chleba idli, są one odpowiedzialne przede wszystkim za spulchnienie ciasta, ale ich metabolity nadają wypiekowi cechy sensoryczne i chronią przed rozwojem mikroflory patogennej. Chleb ten wytwarza się z mytego i moczonego ryżu i fasoli Phaseolus mungo w proporcji 4:1 do 1:4. Dodatek soli wynosi 1%.
Proces fermentacji trwa 12-24 godzin w temperaturze 30-32°C, a przeprowadzają go bakterie Leuconostoc mesenteroides i Enterococcus faecalis. Po zakończeniu fermentacji ciasto dzieli się na małe kawałki i gotuje na parze. W podobny sposób wytwarza się dosa i dhokla, z tym że surowcem w tym przypadku jest ciecierzyca.
Ciasto z kukurydzy
W Afryce fermentowana żywność jest powszechnie produkowana. Wynika to z niskiego stanu higieny, wysokich temperatur, wilgotności i braku urządzeń do chłodzenia żywności. Powodują one wysokie ryzyko rozwoju niepożądanej mikroflory.
Kierowana fermentacja pozwala na zwiększenie bezpieczeństwa żywności, na co w znacznym stopniu wpływają kwasy organiczne wytwarzane przez bakterie Lactobacillus, Leuconostoc i Pediococcus. W krajach afrykańskich popularne są fermentowane ciasta z kukurydzy.
Przy wytwarzaniu uji, ziarno kukurydzy jest czyszczone i moczone do 2 dni w temperaturze otoczenia, potem ziarno się odsącza i na mokro rozdrabnia, a po dodaniu wody i zamieszaniu powstaje sztywne ciasto.
Nigeryjskie ogi tym różni się od powyższej metody, że od rozdrobnionego ziarna usuwa się większe cząstki, dzięki czemu produkt ma delikatną strukturę. Mieszanina fermentuje przez noc. Po odlaniu wody pozostała masa służy do przygotowania gotowanej kaszki.
W przypadku produkcji ugandyjskiego ciasta obusera ziarno kukurydzy i sorgo są mielone na sucho z pominięciem etapu moczenia. Mączkę gotuje się w wodzie i dodaje szczepionkę – produkt z poprzedniej fermentacji.
Kassawa
Innym produktem wytwarzanym na Czarnym Lądzie jest fermentowana kassawa (mąka z manioku), która po ugotowaniu staje się sztywną pastą. Z kassawy można też otrzymać gari, który powstaje w wyniku fermentacji grubo zmielonego surowca, po jego sprasowaniu, odsiewaniu i uprażeniu.
Napoje alkoholowe
Bakterie kwasu mlekowego wykorzystuje się również w produkcji napojów alkoholowych.
Pulgue
Przykładem takiego napoju jest meksykańska pulgue. Zawartość etanolu tego trunku wynosi 4-6%, a odczyn 3,5-4. Surowcem w produkcji tego napoju jest sok z agawy.
Tradycyjna domowa produkcja pulgue opiera się na samorzutnej fermentacji systemie produkcji półciągłej i trwa 8-30 dni. Fermentacja jest przeprowadzana przez bakterie fermentacji mlekowej: L. plantarum i L. brevis, bakterię Zymomonas mobilis i drożdże Saccharomyces cerevisiae.
Chicha
Innym ciekawym napojem z Nowego Świata jest chicha, którą wytwarza się z kukurydzy, którą tradycyjnie przeżuwa się, a amylazy obecne w ślinie rozkładają skrobię. Metoda żucia nadal jest używana przez Indian zamieszkujących Boliwię i Peru.
Dziś najczęstszym surowcem jest mąka kukurydziana, rozcieńczona wodą i ogrzewana do temperatury 75°C. Mąka jest poddawana długotrwałej obróbce cieplnej, następnie z roztworu usuwa się zawiesiny.
Otrzymany klarowny roztwór fermentuje 2-6 dni, a w procesie tym uczestniczą drożdże i bakterie fermentacji mlekowej. Zawartość alkoholu etylowego w chicha wynosi 8-12%.
Natto
Większość bakterii stosowanych w produkcji żywności zakwasza swoje środowisko. Jednakże istnieją też drobnoustroje alkalizujące produkty spożywcze. Przykładem takiej bakterii jest Bacillus subtilis. Bakteria ta jest stosowana w produkcji natto – fermentowanych, gotowanych całych nasion soi.
Dawadawa
Proces fermentacji trwa 14-18 godzin w temperaturze 40°C. W Nigerii przy użyciu tej bakterii otrzymuje się dawadawa. Surowcem do produkcji tego produktu są nasiona wybranych roślin: drzewa świętojańskiego, baobabu, kapoku, melona lub sezamu. Nasiona zostają odłuszczone, ugotowane i posolone. Następnie nasiona przenosi się do pojemników, przykrywa liśćmi ziela babki zwyczajnej i fermentuje 2-3 dni, a następnie suszy (Gawęcki i Libudzisz 2016).
Negatywna rola bakterii w produkcji żywności – psucie żywności, zatrucia pokarmowe
Większość produktów spożywczych jest dobrym środowiskiem do rozwoju bakterii, ponieważ zawiera składniki odżywcze potrzebne drobnoustrojom do wzrostu. Bakterie mogą powodować psucie żywności w różnych warunkach.
Najważniejszym czynnikiem ograniczającym rozwój bakterii jest dostępność wody. Bakterie potrzebują do wzrostu dużej aktywności wody i z tego powodu nie powodują psucia żywności suchej.
Ziarniaki z rodzaju Micrococcus są saprofitami powszechnie występującymi w glebie, powietrzu i wodzie. Istnieją gatunki odporne na wysokie temperatury, zdolne do przetrwania temperatury pasteryzacji. Niektóre gatunki tolerują też niskie temperatury i wysokie stężenia soli.
Bakterie Micrococcus są odpowiedzialne za psucie mleka pasteryzowanego, produktów spożywczych przechowywanych w warunkach chłodniczych i konserwowanej solą. Większość gatunków najlepiej rośnie w temperaturze 25-30°C.
Psucie żywności najczęściej powodują: Micrococcus freudenreichii, M. varians, M. luteus, M. caseolyticus. Bakterie z rodzaju Staphyllococcus wchodzą w skład naturalnej mikroflory skóry i błon śluzowych człowieka.
Największe znaczenie ma gronkowiec złocisty S. aureus, która wytwarza ciepłooporną enterotoksynę, odpowiedzialną za wiele przypadków zatruć pokarmowych. Bakteria ta jest odporna na zasolenie. Temperatura 37°C jest optymalna dla gronkowca, ale rośnie też w niższych temperaturach.
Innymi mikroorganizmami odpowiedzialnymi za psucie żywności są bakterie z rodzaju Enterococcus, zwane też enterokokami lub paciorkowcami kałowymi. Bakterie dobrze rosną w temperaturze 10-45°C. Enterokoki wytrzymują półgodzinne ogrzewanie w temperaturze 60°C. Obecność tych bakterii w żywności jest wskaźnikiem zakażenia fekalnego.
Bakterie te są odpowiedzialne za psucie świeżego mięsa, świeżych i pasteryzowanych produktów mlecznych. E. faecalis i E. faecium mogą powodować zatrucia pokarmowe.
Bakterie z rodzaju Leuconostoc wytwarzają substancje śluzowe. Przyczyniają się do psucia wód gazowanych, lemoniad i produktów mlecznych na skutek ich ześluzowacenia. L. mesenteroides produkuje dekstran, będący gęstą, śluzowatą masą, która jest polimerem glukozy. Bakteria ta powoduje powstanie „żabiego skrzeku” w cukrowniach.
Pałeczki z rodzaju Lactobacillus, zwłaszcza gatunki heterofermentatywne (L. brevis i L. viridescens) mogą powodować psucie piwa, wina i mięsa. L. viridescens jest odpowiedzialny za zielenienie peklowanego mięsa.
Psucie żywności powodują pałeczki termofilne, mezofilne i psychrofilne. Tlenowe i względnie beztlenowe laseczki z rodzaju Bacillus występują powszechnie w glebie i kurzu. Za psucie żywności są odpowiedzialne pałeczki mezofilne i termofilne, o szerokim zakresie optymalnej temperatury (37-55°C). B. subtilis powoduje ześluzowacenie pieczywa, a B. cereus może być przyczyną zatruć pokarmowych.
Do tej grupy bakterii należą gatunki cechujące się tworzeniem ciepłoopornych przetrwalników: B. coagulans i B. stearothermophilus. Bakterie B. coagulans i B. polymyxa psują żywność poprzez wytwarzanie dużych ilości kwasów i gazów.
Beztlenowe laseczki z rodzaju Clostridium są obecne w glebie i szczątkach organicznych, cechują się dużą aktywnością sacharolityczną i gnilną. Wiele gatunków odfermentowuje cukry do mleczanu oraz dwutlenku węgla i wodoru. Termofilna bakteria C. thermosaccharolyticum jest odpowiedzialna za psucie konserw warzywnych, czemu towarzyszy tzw. bombaż mikrobiologiczny.
Mezofilne gatunki proteolityczne psują konserwy mięsne. Bakteriami o znacznej aktywności gnilnej są: C. putrefaciens, C. sporogenes, C. histolyticum. C. butyricum, który fermentuje cukier mleczny i powoduje psucie serów.
Najgroźniejszymi gatunkami są C. botulinum (laseczka jadu kiełbasianego) i C. perfringens (laseczka zgorzeli gazowej). Bakterie te są przyczyną zatruć pokarmowych.
Tlenowe pałeczki z rodzaju Pseudomonas występują powszechnie w wodzie, glebie i rozkładających się resztkach substancji organicznych. Do rozwoju bakterie te wymagają dużej ilości białka i wysokiej aktywności wodnej, natomiast nie korzystają one z sacharydów.
Pseudomonas do przeważnie bakterie psychrofilne, jednakże znoszą szeroki zakres temperatur (15-40°C). Bakterie te są odpowiedzialne za psucie żywności przechowywanej w chłodniach, czyli mięsa, drobiu, ryb i jaj. Powodują one powstawanie barwnych plam, ześluzowacenie powierzchni i nieprzyjemny zapach.
Najpopularniejszym gatunkiem jest P. fluorescens, wytwarzający zielonkawą fluoryzującą substancję na powierzchni żywności. Bakterie z rodzaju Halobacterium np. H. salinarium są odpowiedzialne za psucie żywności o dużej zawartości soli np. solonego mięsa i ryb.
Objawem obecności tych bakterii jest odbarwienie produktu. Bakterie fermentacji octowej są niepożądane w przemyśle fermentacyjnym, z powodu ich zdolności do utleniania etanolu do octanu. Najpopularniejszymi gatunkami są: Acetobacter aceti, A. pasteurianum i A. viscosum.
Za powstawanie żółtych lub pomarańczowych plam na maśle, jajach i rybach są odpowiedzialne bakterie z rodzaju Flavobacterium, których niektóre szczepy mogą powodować psucie owoców, warzyw i ryb.
Bakterie z rodzaju Alcaligenes uczestniczą w psuciu mięsa i ryb.
Drobnoustrojami niepożądanymi w żywności są przedstawiciele rodziny Enterobacteriaceae, jednakże tylko nieliczne z nich powodują zatrucia pokarmowe lub choroby.
Istnieją gatunki, które tworzą szkodliwe dla zdrowia aminy biogenne w wyniku dekarboksylacji niektórych aminokwasów. Popularnymi bakteriami tej grupy są: Shigella, Salmonella i Escherichia coli.
Wybrane szczepy E. coli przeprowadzają fermentację pseudomlekową, co prowadzi do psucia żywności. Bakterie z rodzaju Erwinia (E. amylovora, E. carotovora) powodują gnicie warzyw.
Rodzaj Serratia (np. S. marescens) potrafi rozkładać białka i lipidy, syntetyzują ponadto czerwony barwnik wywołujący plamy na powierzchni żywności.
Bakterie z rodzaju Proteus są odpowiedzialne za gnicie produktów białkowych – mięsa, ryb i jaj. Nadmierna ich ilość w żywności może skutkować zatruciami pokarmowymi (Trojanowska, Giebel i Gołębiowska 2014).
Lipolisacharydy
Bakterie bytujące w żywności często tworzą toksyny. Toksyna bakteryjna to makrocząsteczka głównie pochodzenia białkowego, która może powodować uszkodzenia w określonym narządzie żywiciela. Toksyny można podzielić na endotoksyny i egzotoksyny.
Endotoksyny, zwane też lipopolisacharydami (LPS) są to składnikami błony zewnętrznej bakterii gramujemnych. LPS są uważane za najważniejszy antygen bakterii, są uwalniane do otoczenia po różnych procesach, takich jak liza i podział komórki. Endotoksyna może powodować wstrząs endotoksyczny i uszkodzenie tkanek.
LPS składają się z 3 części:
- lipid A to glikolipid utworzony przez disacharyd glukozaminę, który jest związany z kwasami tłuszczowymi (kwas kaprynowy, laurynowy, mirystynowy, palmitynowy i stearynowy), które są wprowadzane do zewnętrznej błony bakterii.
- heteropolisacharyd pochodzący z heksoz i heptoz. Lipid A i heteropolisacharyd są związane przez 2-keto-3-deoksyoktanian kwasu cukrowego (KDO).
- łańcuch O to powtarzająca się jednostka polimeru złożona z 1–8 reszt glikozydowych; ten polimer jest bardzo zmienny w zależności od gatunku i rodzaju bakterii.
Egzotoksyny są to makrocząsteczki pochodzenia białkowego, które są produkowane i później uwalniane do otoczenia. W zależności od mechanizmu działania, egzotoksyny są podzielone na 3 grupy:
- toksyny typu I – modyfikują one komórki żywiciela np. superantygeny wytwarzane przez Staphylococcus aureus i Streptococcus pyogenes.
- toksyny typu II – do tej grupy należą hemolizyny i fosfolipazy, charakteryzują się one tworzeniem porów i niszczeniem błon komórkowych komórki gospodarza. Dzięki temu czynnikowi zjadliwości patogen może zaatakować komórkę gospodarza;
- toksyny typu III – cechują się one binarną strukturą (frakcja A i B). Frakcja B wiąże się z receptorem komórki, a frakcja A posiada aktywność enzymatyczną, która w zależności od toksyny i mechanizmu jej działania będzie powodować uszkodzenie komórki np. toksyna Shiga produkowana przez Escherichia coli O157: H7, toksyna cholery (Ctx) wytwarzana przez Vibrio cholerae
Toksyny wytwarzane przez patogeny, powodujące choroby przenoszone przez żywność są następujące:
- toksyna cholery (Vibrio cholerae)
- toksyna termolabilna, toksyna termostabilna (E. coli)
- toksyna Shiga (Shigella dysenteriae i E. coli O157: H7)
- toksyna botulinowa (Clostridium botulinum)
- enterotoksyna CPE (Clostridium perfringens)
- alfa-toksyna, beta-toksyna, epsilon-toksyna, jota-toksyna (C. perfringens)
- toksyna A i toksyna B (Clostridium difficile)
- enterotoksyny (A, B, C1, C2, D, E, G, H, I, J)
- toksyna zespołu wstrząsu toksycznego, hemolizyna BL, niehemolityczna enterotoksyna (S. aureus)
- cytotoksyna K lub CytK (Bacillus cereus)
Choroby wywoływane przez bakterie w żywności
Łącznie 66% chorób przenoszonych przez żywność jest wywoływanych przez bakterie. Główne choroby obejmują botulizm wywołany przez C. botulinum, zapalenie żołądka i jelit wywołane przez szczepy E. coli, salmonellozę i zatrucie gronkowcami.
W niektórych krajach najbardziej rozpowszechnione jest zatrucie pokarmowe wywołane przez bakterię S. aureus, która może być odpowiedzialna nawet za 41% ognisk zatruć pokarmowych.
Chociaż może dotyczyć to ludzi w każdym wieku, przedział z największą zachorowalnością wynosi od 20 do 49 lat, gdzie można skoncentrować do 48% przypadków. Główne produkty spożywcze związane z zatruciami pokarmowymi powodowane przez S. aureus to drób i jajka, ciasta, makarony, sosy, mleko i produkty pochodne.
Zatrucie pokarmowe wywołane przez B. cereus może wystąpić o każdej porze roku, bakteria ta łatwo przenosi się w różnych rodzajach żywności, zwłaszcza w tych pochodzenia roślinnego, np. zbóż.
Zatrucia pokarmowe spowodowane przez ten patogen zajmuje od 1 do 17,5% wszystkich przypadków zatruć pokarmowych wywołanych przez bakterie. Zatrucia pokarmowe wywoływane przez C. botulinum są rzadsze, najczęstszą przyczyną zatruć jest spożywanie konserw. Zatrucie pokarmowe wywołane przez C. perfringens w 90% przypadków jest spowodowanych przez spożycie mięsa i produktów drobiowych (Hernández-Cortez i in 2017).
Podsumowanie
Dzięki bakteriom można otrzymać wiele produktów o wysokiej wartości odżywczej i atrakcyjnych pod względem sensorycznym. Jednakże, nieodpowiednie przechowywanie żywności może doprowadzić do jej zepsucia, a spożycie takich produktów stwarza zagrożenie dla zdrowia. Podsumowując, bakterie, mimo swej prostoty pełnią ważną rolę życiu człowieka.
Bibliografia:
- Bisen P.S. (2014) Microbes in food and dairy production. Pobrano z: https://www.researchgate.net/publication/299977950_MICROBES_IN_FOOD_AND_DAIRY_PRODUCTIONhttps://www.researchgate.net/publication/299977950_MICROBES_IN_FOOD_AND_DAIRY_PRODUCTION (11.2014)
- Gawęcki J., Libudzisz Z. (2016) (red.) Mikroorganizmy w żywności i żywieniu. Poznań: Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, s. 54-74
- Hernández-Cortez C., Palma-Martínez I., Gonzalez-Avila L.U., Guerrero-Mandujano A., Solís R.C., Castro-Escarpulli G. (2017) Food poisoning caused by bacteria (food toxins). Pobrano z: https://www.researchgate.net/publication/321957191_Food_Poisoning_Caused_by_Bacteria_Food_Toxinshttps://www.researchgate.net/publication/321957191_Food_Poisoning_Caused_by_Bacteria_Food_Toxins (12.2017)
- Nicklin J., Graeme-Cook K., Killington R. (2012) Mikrobiologia. Krótkie wykłady. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, s. 73-95
- Trojanowska K., Giebel H., Gołębiowska B. (2014) Mikrobiologia Żywności. Poznań: Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, s. 95-103
