Odkrywamy powiązania w mikrobiomie jelitowym – wyniki sekwencjonowania w projekcie NANOBIOME

Kiedy przychodzimy na świat, nasz noworodkowy układ pokarmowy jest niemal sterylny. Poszczególne bakterie zaczynają kolonizować jelita w kontakcie ze środowiskiem zewnętrznym. Zwykle pierwsze bakterie pochodzą z kontaktu z drogami rodnymi oraz skórą matki. U dzieci, które przyszły na świat przez cesarskie cięcie, będą to inne bakterie, głównie związane ze skórą opiekunów oraz otoczeniem szpitalnym. Kolejni „przybysze” będą ściśle związani ze środowiskiem, w jakim dorasta dziecko. Badania naukowe wielokrotnie wykazywały, że członkowie danej rodziny, społeczności czy nawet narodowości mają podobny zestaw bakterii. Przypuszcza się, że proces zasiedlania układu pokarmowego przez bakterie trwa około 2 lata. Po tym czasie przyjmuje się, że kompozycja bakterii stabilizuje się. Oznacza to, że nowi przybysze będą traktowani jak intruzi. Jest to słuszna ewolucyjnie droga, która między innymi chroni nas przed bakteriami patogennymi. Ale co z bakteriami, które nie zdążyły zasiedlić się w ciągu tych 2 lat?

Badania naukowe sugerują, że proces kolonizacji układu pokarmowego w XX wieku został znacznie zaburzony. Wszystko za sprawą zwiększonej higieny. Kraje rozwinięte posiadające wysokie standardy higieny mają najniższy współczynnik umieralności wśród noworodków, ale też najwyższy współczynnik alergii i chorób o podłożu immunologicznym. Innymi słowy, sterylne warunki pozwalają przeżyć większej ilości noworodków, ale brak kontaktu z pewnymi, pożądanymi bakteriami powoduje zaburzenia w rozwoju układu immunologicznego, prowadząc do alergii czy chorób takich jak cukrzyca, otyłość, astma, nieswoiste zapalenie jelita bądź łuszczyca.

Łatwo można sobie wyobrazić, że na ostateczny kształt naszego mikrobiomu będzie miała wpływ ogromna ilość czynników: zaczynając od porodu, przez sposób karmienia, ale też od tego, czy na przykład, raczkując, wkładaliśmy do buzi „brudne” klocki, lub czy mamy w domu kota albo psa. Z uwagi na ogromną ilość zdarzeń losowych, które mogą ostatecznie wpłynąć na to, jaką florę bakteryjną rozwiniemy, przyjmuje się, że nasza kompozycja bakterii jest unikalna dla każdego z nas. W badaniach nad bliźniętami jednojajowymi wykazano, że nie można ich odróżnić po profilowaniu genetycznym, jednak można ich rozróżnić na podstawie ich mikrobiomu! 

Od momentu, gdy pierwsze badania naukowe udowodniły zależność pomiędzy mikrobiomem a stanem zdrowia, pojawiło się zasadnicze pytanie: jak zatem wygląda mikrobiom zdrowego człowieka? Niestety, na razie nauka nie znalazła jednoznacznej odpowiedzi na to pytanie. Jest to głównie związane ze wspomnianym wyżej faktem, że każdy mikrobiom jest na swój sposób unikalny, a więc niełatwo jest go zaszufladkować
w proste odpowiedzi. 

Okazuje się jednak, że można określić parametry i pewne charakterystyki mikrobiomu, które najczęściej związane są z wystąpieniem chorób. Na przykład niska bioróżnorodność mikrobiomu najczęściej skorelowana jest ze stanami chorobowymi. W prostych słowach: im mniej różnych bakterii posiadamy, tym nasz układ odpornościowy jest najprawdopodobniej gorzej rozwinięty, a bakterie, z uwagi na okrojony potencjał genetyczny, są zdolne do podjęcia mniejszej ilości zadań. Co więcej, mając dostęp do precyzyjnych danych takich jak informacja na poziomie gatunku lub potencjał genetyczny naszych bakterii, jesteśmy w stanie sprawdzić między innymi, jak nasz mikrobiom radzi sobie z produkcją niezbędnych witamin czy metabolizmem określonych substratów.

Mając na uwadze wszystkie powyższe aspekty spółka genXone zdecydowała się na uruchomienie projektu NANOBIOME, którego celem jest budowanie pierwszej na świecie bazy danych pozwalającej na wyciąganie bardziej precyzyjnych wniosków na temat mikrobiomu jelitowego. Oczywiście jej tworzenie to długofalowy proces, który wymaga przeprowadzenia wielu analiz, a niektóre informacje będą możliwe do głębszej oceny dopiero w przyszłości, gdy nauka dostarczy więcej  wniosków i dowodów. Jednak już teraz, dysponując bazą pierwszych wyników sekwencjonowania próbek kału, które zebrane były w ramach realizowanego projektu NANOBIOME, eksperci z genXone znaleźli pierwsze zależności pomiędzy zidentyfikowanymi bakteriami a stylem życia i odczuciami uczestników. Te pierwsze analizy wskazały kilka ciekawych wniosków, a to dopiero początek.

Próbki kału zbierane były w ubiegłym roku od zdrowych Polaków i poddane analizie sekwencjonowania całogenomowego w technologii Nanopore. Zaletą tej technologii jest duża dokładność w ocenie ilościowego składu próbki dzięki odczytom długich fragmentów DNA. Na podstawie bakterii zidentyfikowanych w próbkach wyłoniliśmy grupy o podobnych profilach mikrobiomu, czyli tzw. enterotypach. Zdecydowana większość próbek należy do enterotypu Bacteroides, który jest charakterystyczny u osób spożywających dużo mięsa i tłuszczy zwierzęcych, natomiast mniej węglowodanów i błonnika. Przeprowadzona analiza bioinformatyczna wskazała, że klasyfikacja enterotypów na 3 grupy: Bacteroides, Prevotella i Ruminococcus, która pojawia się często w literaturze[Arumugam 2011], wymaga pogłębienia. W ten sposób wyłoniliśmy enterotypy towarzyszące, które również należy rozpatrywać w ogólnej ocenie mikrobiomu.

Uczestnicy badania oprócz przekazania materiału do laboratorium genXone zostali również poproszeni o uzupełnienie ankiety dotyczącej stylu życia, odżywiania czy indywidualnej oceny własnej kondycji. Te informacje porównaliśmy z wynikami badania, co potwierdziło, że występuje związek między mikrobiomem jelitowym, a różnymi odczuciami czy objawami. Analiza potwierdza bowiem, że osoby zgłaszające słabsze zdrowie należą do tych z mniejszą różnorodnością bakterii w jelicie. Dodatkowo, osoby nieodczuwające żadnych dolegliwości jelitowych takich jak wzdęcia, zaparcia czy ból brzucha to również osoby o niższym zróżnicowaniu mikroflory, co może wynikać z mniejszej aktywności biologicznej, a więc mniejszej ilości procesów fermentacyjnych zachodzących w jelitach.

Kolejna widoczna zależność z pewnością nie będzie zaskoczeniem, bowiem dotyczy ona negatywnego wpływu posiłków typu fast-food oraz napojów gazowanych. Nasze analizy potwierdziły, że osoby deklarujące częste spożycie tego rodzaju pożywienia i napojów charakteryzują się znacznie niższą różnorodnością. Jednocześnie ciekawą rzeczą, którą zauważyliśmy, jest to, że bardzo zdrowa dieta niekoniecznie oznacza różnorodny mikrobiom. Ci uczestnicy, którzy ocenili swoją dietę jako „bardzo zdrową” nie należą do grupy 25% osób o najwyższej różnorodności bakterii jelitowych. Oczywiście nie można na tej podstawie stwierdzić, że dieta postrzegana jako „bardzo zdrowa” ma negatywny wpływ na różnorodność mikrobiomu, jednak można wnioskować, że wysoki poziom różnorodności pokarmów, nawet tych domniemanie niezdrowych (jak na przykład słodycze), ale spożywanych z odpowiednim ograniczeniem, może mieć wpływ na odpowiednio wysoką różnorodność bakterii zasiedlających jelita. Z drugiej strony warto krytycznie spojrzeć na niektóre wykluczenia z diety. Otóż te najbardziej restrykcyjne, jak dieta wegańska czy wegetariańska, również nie wykazały widocznie zwiększonego indeksu różnorodności. Najbogatsze zbiorowisko bakterii obserwujemy u osób, które spożywają mięso 2-5 razy w tygodniu.

Rys. 1. Różnorodność mikrobioty mierzona miarą InvSimpson, która daje wysokie wyniki dla próbek o różnorodnym składzie oraz równomiernych ilościach bakterii, w podziale na deklarowaną przez uczestników jakość własnej diety. 

Mimo wszystko już od dawna mówi się o tym, że podstawą diety powinny być warzywa i owoce – i rzeczywiście – niski indeks różnorodności wykazują te osoby, które rzadziej niż raz w tygodniu spożywają warzywa i owoce, ale także produkty zbożowe czy produkty bogate w tłuszcze nasycone (takie jak masło, ser). Co istotne, Ci uczestnicy, którzy nie deklarowali spożywania produktów probiotycznych na przykład kefirów i kiszonek, na temat których pojawia się wiele publikacji, także w większości znajdują się w dolnej połowie wartości indeksu różnorodności.

Negatywny wpływ palenia papierosów na zdrowie chyba nie pozostawia żadnych wątpliwości, a nasze badania również potwierdzają jego związek z różnorodnością mikrobioty. Oczywiście nie możemy jednoznacznie wskazać czy wpływ ten jest bezpośredni, czy być może jest on związany z innymi zachowaniami i przyzwyczajeniami palaczy, jednak z pewnością osoby palące lub używające innych wyrobów nikotynowych mają większą szansę, że znajdą się wśród 25% osób o najmniejszej różnorodności.

Ciekawą zależność zauważyliśmy u osób zgłaszających częste problemy z koncentracją i pamięcią. Otóż mają one relatywnie niską różnorodność gatunkową, a dodatkowo niektóre modele liniowe* przewidują, że jest to związane między innymi z niskim poziomem bakterii, które zaangażowane są w produkcję serotoniny, a wysokim poziomem bakterii produkujących neurotransmiter GABA. Podobnie jest wśród osób z problemami ze zdrowiem psychicznym (takimi jak depresja, zaburzenia odżywiania) – są one raczej w grupie osób o mniejszej różnorodności gatunkowej, a model liniowy przewidujący wystąpienie tych problemów wskazuje na wpływ bakterii produkujących witaminę K. Ich mniejsza liczba najlepiej przewiduje występowanie tych zaburzeń, chociaż oczywiście jest to pewien trend, a nie zero-jedynkowa zależność, szczególnie, że dotyczy obserwacji na stosunkowo niewielkiej liczbie uczestników. 

Rys. 2. Wykres obrazuje, jak dużą część wszystkich bakterii stanowią bakterie mogące produkować witaminę K u osób z depresją i zaburzeniami odżywiania oraz bez tych problemów. Przedstawiona na osi Y wartość jest logarytmem częstości przesuniętym tak, aby mediana wynosiła 0. Krzywe przybliżają rozkład częstości tej wartości dla poszczególnych grup, a punkty pokazują dokładne wartości.

Badania nad mikrobiomem stanowią obecnie pasjonującą dziedzinę naukową, przynoszącą nieustannie nowe odkrycia i powiązania. Jako genXone staramy się poznać mikrobiotę bardzo dokładnie tak, aby jak najlepiej odpowiedzieć na kluczowe potrzeby współczesnego świata. Troska o te najmniejsze istoty zamieszkujące nasze jelita staje się dzisiaj punktem obowiązkowym przy tworzeniu diet i idealnie wpisuje się w zdrowy tryb życia. Z niecierpliwością oczekujemy kolejnych danych o mikrobiomie wypływających
w ramach projektu NANOBIOME. Z pewnością przyniosą one kolejne interesujące wnioski.

Tabela podsumowująca obserwacje związane ze zmniejszeniem różnorodności:

Cecha	Charakterystyka osób zgłaszających daną cechę	p-wartość **
Ogólna ocena zdrowia jako zła	Osoby te częściej są w dolnej połowie pod względem różnorodności	0.125
Brak dolegliwości brzusznych	Osoby bez dolegliwości brzusznych istotnie częściej są w dolnej połowie pod względem różnorodności	0.0085
Spożywanie fast-foodów częściej niż raz w tygodniu	Osoby spożywające fast-foody istotnie częściej są w dolnej połowie pod względem różnorodności	0.0096
Spożywanie napojów gazowanych częściej niż kilka razy w miesiącu	Osoby spożywające napoje gazowane częściej znajdują się w dolnej połowie osób o najmniejszej różnorodności	0.1142
Ogólna ocena diety jako bardzo zdrowa	Osoby uznające swoją dietę za bardzo zdrową rzadziej znajdują się w grupie 25% osób o najwyższej różnorodności	0.06
Ogólna ocena diety jako niezdrowa lub bardzo niezdrowa	Osoby uznające swoją dietę za niezdrową lub bardzo niezdrową rzadziej znajdują się w grupie 25% osób o najwyższej różnorodności	0.28
Spożywanie raz w tygodniu lub rzadziej: – warzyw – owoców – produktów zbożowych  – produktów bogatych w tłuszcze nasycone (np. masło, ser)	Osoby rzadko spożywające warzywa, owoce, produkty zbożowe rzadziej znajdują się w górnej połowie osób o najmniejszej różnorodności, a osoby rzadko spożywające tłuszcze nasycone w górnych 25%	0.035 0.143 0.151 0.214
Niespożywanie produktów probiotycznych np. kefirów i kiszonek	Osoby, które nie spożywają produktów probiotycznych istotnie częściej są w dolnej połowie pod względem różnorodności	0.032
Palenie papierosów	Osoby palące istotnie częściej są grupie 25% osób o najniższej różnorodności	0.022
Zgłoszone dolegliwości częściej niż kilka razy w miesiącu: – problemy z koncentracją – problemy z pamięcią	Osoby zgłaszające problemy z pamięcią czy koncentracją nieznacznie częściej są grupie 50% osób o najniższej różnorodności	0.351 0.332
Zgłoszone problemy ze zdrowiem psychicznym (np. depresja, zaburzenia odżywiania)	Osoby z problemami ze zdrowiem psychicznym nieznacznie częściej są w grupie 50% osób o najniższej różnorodności	0.254

*Dwumianowe uogólnione modele liniowe (Generalized linear model) przewidujące występowanie danej cechy na podstawie logarytmów odchylenia od mediany zawartości bakterii z danej grupy w próbce.

** P-wartości wyliczone przy pomocy testu dwumianowego porównującego rozkład wartości różnorodności mikrobiomu osób deklarujących daną cechę większej, do różnorodności u wszystkich badanych. Wartość oznacza w jakim procencie obserwacja jest przypadkowa np. 0.05 oznacza szansę na przypadkowość 5%.

Autorzy:

Mgr Julia Herman-Iżycka – Bioinformatyk genXone S.A.
Dr Maciej Sykulski – Koordynator ds. Naukowych genXone S.A.
Prof. Łukasz Krych – Dyrektor działu Badań i Rozwoju genXone S.A.

Bibliografia:

Arumugam, Manimozhiyan, et al. „Enterotypes of the human gut microbiome.” Nature 473.7346 (2011): 174-180.